Світова коронавірусна криза

Сергій КОМІСАРЕНКО,
академік НАН України і НАМН України, академік-секретар Відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології НАН України, директор Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, голова Комісії з біобезпеки і біозахисту при РНБО України

Продовження. Початок у ч. 40-42 за 2020 рік

Діагностика SARS-CoV-2 і COVID-19
Серед великої кількості різних, зокрема сучасних, часто дуже коштовних і складних методів виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 та діагностики захворювання COVID-19, яке SARS-CoV-2 викликає, є дві групи діагностичних тестів, які найбільш поширені і загальноприйняті. Перша група тестів спрямована на пряме визначення РНК вірусу (чи його частин) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а друга — на визначення у пацієнтів антитіл проти вірусу (незалежно від того, чи є пацієнт у цей момент носієм вірусу, чи ні), тобто на пошук “слідів” від перенесеної вірусної інфекції. Такі антитіла (як правило, IgG класу) залежно від багатьох чинників можуть залишатися в крові у пацієнта від кількох місяців до багатьох років.
ПЛР-тести для виявлення вірусу. На початку пандемії ВООЗ розробила некомерційні лабораторні протоколи, більшість з яких було призначено для діагностики за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі зі зворотною транскрипцією (rRT-PCR — reverse transcription real-time polymerase chain reaction). Головні “мішені” в геномі SARS-CoV-2, що використовували для діагностики в різних країнах за допомогою ПЛР, наведено в таблиці.

Таблиця
Гени-“мішені” в геномі SARS-CoV-2
для ПЛР-діагностики в різних країнах
Країни, установи Гени-“мішені”
Китай (Центр з контролю та профілактики захворювань) ORFlab, N
Франція (Інститут Пастера у Парижі) RdRP2 (2 сайти)
США (Центр з контролю та профілактики захворювань) N (3 сайти)
Японія (Національний інститут інфекційних захворювань) Pancorona, Spike
Німеччина (Клініка Шаріте) RdRP, Е, N, HKU
Гонконг SAR ORFlb-nspl4, N
Таїланд (Національний інститут здоров’я) N

Уже розроблено багато комерційних аналізів, які виявляють вірус SARS-CoV-2. Фонд інноваційної нової діагностики (Foundation for Innovative New Diagnostics — FIND) у Женеві, який підтримує створення та доставку діагностикумів у країни з низьким рівнем доходу, розмістив на своєму сайті інформацію про 803 діагностичних засоби, з яких приблизно половину (411 розробок) становлять тести на основі імуноензимного аналізу, а решту — ПЛР-тести для виявлення РНК вірусу (365 розробок) та інші діагностикуми (і цей список постійно поповнюється).
Більшість доступних діагностичних засобів для виявлення генетичного матеріалу вірусу SARS-CoV-2 — це набори для rRT-PCR. Незважаючи на те, що одночасне виявлення кількох цільових послідовностей РНК коронавірусу за допомогою мультиплексної rRT-PCR є досить складним і тривалим процесом, який можна проводити лише в лабораторних умовах, оскільки він потребує наявності спеціального устаткування, відповідних реагентів та підготовленого персоналу, саме цей тип діагностикумів залишається основним у центральних лабораторіях для тестувань на наявність вірусу. Великі компанії, такі як Roche Diagnostics, Thermo Fisher Scientific, Qiagen, Quest Diagnostics, розширюють можливості для проведення таких досліджень, впроваджуючи автоматизовані системи тестування на SARS-CoV-2.
Вітчизняний ПЛР-тест на коронавірус на замовлення РНБО України вчені Інституту молекулярної біології і генетики НАН України зробили вже в лютому 2020 р. Його виробництво було передбачено Указом Президента України від 13.03.2020, який так і не було виконано через відсутність державного фінансування.
Наразі в Україні використовують, на жаль, у недостатній кількості, ПЛР-тести як іноземного виробництва, так і виготовлені вітчизняними приватними компаніями. Однак у нас немає даних про якість цих тестів. Невідома частка хибнопозитивних і хибнонегативних вимірювань вкрай ускладнює об’єктивний контроль над епідеміологічною ситуацією в Україні.
Повідомлялося, що після одужання від COVID-19 14% виписаних з лікарень пацієнтів з негативними результатами ПЛР-тесту через деякий час знову мали позитивний результат. Ці спостереження поставили багато нових запитань: чи є коректними ПЛР-тести зразків, узятих з горла (можливо, коронавірус ще наявний у клітинах легень); чи може бути вірус “двофазним” (як сибірка), залишаючись “сплячим” перед появою нових симптомів; чи можливе повторне інфікування людини після одужання внаслідок недостатньо потужної імунної відповіді (низького рівня антитіл до вірусу)?
Донедавна вважалося, що раптові позитивні результати не пов’язані з повторним інфікуванням, а пояснюються більш затяжною інфекцією або виявленням залишко­вих фрагментів РНК вірусу, що поступово руйнуються в клітинах. Однак порівняльні геномні дослідження ізолятів SARS-CoV-2, виділених у однієї людини при повто­ренні позитивних результатів тестів, довели, що можливість повторного зараження виключати не можна.
Оскільки у значної кількості людей, заражених вірусом SARS-CoV-2, інфекція проходить безсимптомно, або розповсюдження вірусу починається до появи симптомів, необхідно терміново збільшити можливості діагностичного тестування, щоб запобігти поширенню хвороби. Одним із способів, який може допомогти в цьому, є розроблення тестів для виявлення SARS-CoV-2 на основі принципу об’єднання, згідно з яким кожен зразок розподіляється на декілька пулів за допомогою комбінаторної стратегії об’єд­нання, та можна визначити всіх позитивних суб’єктів у наборі зразків за допомогою одного раунду тестування. Зокрема, було розроблено такий тест P-BEST для виявлення SARS-CoV-2 в слині, за допомогою якого протягом 2 годин було протестовано 384 зразки, об’єднані у набори з 48 пулів, що дозволило у 8 разів збільшити ефективність тестування та у 8 разів зменшити витрати на тестування, виявивши одночасно до 5 позитивних носіїв.
Серологічні тести для виявлення противірусних антитіл або вірусу. Різні виробники створили велику кількість тестів для виявлення антитіл проти SARS-CoV- 2, що з різною чутливістю визначають антитіла IgM- та IgG-класів у крові хворих. Розроблення таких тестів є відносно простим завданням, оскільки потребує лише отримання рекомбінантних антигенів вірусу, що сорбуються на нерозчинній поверхні діагностикуму для зв’язування зі специфічними до них антитілами з крові інфікованої людини з подальшим виявленням цих антитіл, як правило, методом імуноферментного (імуноензиматичного) аналізу — Enzyme Linked Immunosorbent Assay, або ELISA.
Основна проблема серологічних тестів, які визначають наявність антитіл до вірусу в крові пацієнта, є очевидною — перші антитіла (IgM-класу) з’являються не відразу, а лише через 5—8 днів після інфікування і поступово зникають, а більш численні і більш специфічні антитіла IgG-класу з’являються ще пізніше, досягаючи максимуму на 24—28 день, і можуть залишатися в сироватці крові роками.
Тести на наявність антитіл використовують для контролю за формуванням колективного імунітету в популяції і для виявлення людей, які вже перехворіли на COVID-19 (вони вже можуть не мати вірусів SARS-CoV-2). Такі люди можуть стати донорами реконвалесцентної сироватки, яка зараз розглядається як один із реальних засобів для лікування важкохворих.
В Україні вже є у продажу кілька імунотестів вітчизняного виробництва для виявлення IgM- i IgG-антитіл проти SARS-CoV-2, наприклад “АТ-Коронавірус-тест-МБА” ви­робництва ТОВ “МедБіоАльянс” та “COVID-19 IgM/IgG” виробництва ТОВ “Інноваційні біологічні технології”. Крім того, вчені Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України у співпраці з ПАТ “НВК “Діапроф-мед” розробили імуноензимний діагностикум для детекції ^М та IgG проти SARS-CoV-2 у мікропланшетах. Проте, як і в ситуації з ПЛР-тестами, даних про якість іноземних та вітчизняних серологічних тестів, що використовують в Україні, немає.
Розроблення імунодіагностикумів для виявлення не антитіл, а самого вірусу та його антигенів є більш складним завданням, оскільки потребує наявності високоспеци фічних моноклональних або рекомбінантних антитіл проти антигенів SARS-CoV-2. Компанія Sona Nanotech (Канада) розробила тест для виявлення антигенів SARS-CoV-2, головною “мішенню” якого є домен S1 протеїну S “шипа” коронавірусу, який відповідає за зв’язування з ACE2 та проникнення вірусу до епітеліальних клітин дихальних шляхів. У планах компанії — розроблення подвійного тесту для одночасного виявлення SARS-CoV-2 і вірусу грипу.
Група вчених з Центру геномних досліджень Академії Синіка (Тайвань) стверджує, що всього за 19 днів вони першими одержали кілька високоспецифічних моноклональних антитіл, що розпізнають нуклеокапсидні протеїни N вірусів SARS-CoV-2, SARS-CoV поодинці, а також обох цих вірусів одночасно і не реагують з протеїнами N інших коронавірусів людини. Ці антитіла могли б стати основою для розроблення швидких тестів для виявлення антигенів SARS-CoV-2. Отримати антитіла так швидко (заощадивши два місяці порівняно з традиційними методами) вченим дозволило використання замість імунізації тварин моделей взаємодії антитіло—антиген, створених штучним інтелектом, які застосовували для одержання бібліотек штучних антитіл. Розраховані послідовності ДНК, що кодують моноклональні антитіла, одержували хімічним синтезом, антитіла синтезували на їх основі в бактерійних системах експресії та відібрали за активністю зв’язування.
Зараз є значна потреба в так званих POC (Point-Of-Care)-тестах, які не потребують складного лабораторного устаткування, і тому їх можна робити навіть вдома. Використання таких тестів прискорює прийняття клінічних рішень і зменшує навантаження на центральні лабораторії. Компанія Cepheid була першою у США, яка отримала дозвіл від FDA на використання POC-тестів. Розроблений нею тест на SARS-CoV-2 виконується на автоматизованих апаратах компанії GeneXpert Systems без надсилання зразків (назофарингеальних мазків, носових змивів чи аспіратів) у лабораторію і триває 45 хв. Водночас пропускна здатність цих апаратів обмежена, оскільки один прилад не може тестувати одночасно більше одного зразка, а загальна кількість апаратів у США (станом на березень 2020 р.) лише 5 тис.
У травні 2020 р. FDA надало дозвіл на POC-тест FIA Sofia 2 SARS виробництва компанії Quidel (США) для виявлення протягом 15 хв нуклеокапсидного протеїну SARS-CoV-2 (або SARS-CoV) у змивах з носу. Цей імунохроматографічний тест використовує принцип флуорес­центного імуноензимного “сендвіч”-аналізу, результат якого визначається автоматично за допомогою приладу-аналізатора Sofia 2. Дозвіл від FDA на використання РОС-тестів одержали також інші компанії: тест компанії Mesa Biotech (США) триває 30 хв і виконується на приладах Accula System-30, а тест однієї з найбільших компаній світу — Abbott Diagnostics (США) триває від 5 до 13 хв і виконується на платформі Abbott’s ID Now, яких у світі є приблизно 18 тис.
Компанія Pharmact (Німеччина) вивела на ринок швидкий тест, який триває 20 хв, для виявлення антитіл до трьох антигенів SARS-CoV-2 (протеїну N, а також доменів S1 і S2 протеїну S). Тест виявився надзвичайно специфічним: він не дав жодного хибнопозитивного або хибнонегативного результату під час випробувань на 114 інфікованих SARS- CoV-2 і 126 неінфікованих людях. Його чутливість до IgM на 4—10-й день хвороби становила 70%, на 11—24-й день — 92,3%, а чутливість до IgG на 11—24-й день — 98,6%.
Є відомості про розроблення РОС-тестів на основі технології цілеспрямованого редагування геному — CRISPR-Cas. За даними FIND, такими розробками займаються компанії: MGI Tech Co. Ltd (Китай) і Sherlock Biosciences (США). У цьому напрямі працює також компанія Mammoth Biosciences (США), яка разом з Каліфорнійським університетом у Сан-Франциско та Каліфорнійським департаментом громадського здоров’я нещодавно заявила про розроблення та випробування діагностикуму з тривалістю аналізу 45 хв (разом з етапом виділення РНК). Цей діагностикум використовує зворотну транскрипцію ­вірусної РНК і спрощену методику ампліфікації нуклеїнових кислот LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), яка не потребує повторних циклів нагрівання та охолодження. Після ампліфікації нуклеїнова кислота зв’язується з РНК-зондом (gRNA), який розпізнає послідовності генів E та N вірусу SARS-CoV-2, а також з ферментом lbCas12a, що руйнує сусідні незв’язані ділянки одноланцюгової ДНК, після чого флуоресцентні молекули-репортери підтверджують наявність вірусної РНК.
Цей метод є дуже простим у виконанні: фактично для проведення аналізу потрібні лише пробірка з реактивами вартістю $1, піпетка, конфорка і каструля з водою. І хоча тести на основі LAMP є менш чутливими у порівнянні з RT-PCR (дозволяють виявляти вірус у 90% випадків), однак вони не потребують дорогого обладнання та реактивів і можуть використовуватись в польових умовах та в регіонах з поганим оснащенням лабораторій.
Масове тестування населення є одним з важливих засобів стримування пандемії COVID-19. У квітні Національний інститут охорони здоров’я США виділив $1,5 млрд. на розробку тестів на коронавірус, маючи на меті забезпечити мільйони тестів на тиждень до кінця цього літа. Тому зараз активно розробляються діагностичні методи, які дозволяють одночасно перевірити значну кількість зразків. Так, вчені з Державного університету штату Пенсильванія (Стейт Коледж, США) винайшли спосіб протестувати за один раз зразки майже 20 тис. людей. Їхній метод ґрунтується на додаванні до клінічних зразків перед їх об’єднанням “молекулярних штрих-кодів”, які після проведення аналізу дозволяють визначити, які зразки дали позитивний результат. Оскільки ДНК-секвенатори можуть аналізувати одночасно сотні мільйонів фрагментів ДНК, дослідники підрахували, що тести на основі секвенування можуть бути використані для аналізу до 100 тис. зразків за один цикл. На відміну від цього, стандартний прилад для ПЛР може одночасно аналізувати лише десятки або сотні зразків. Однак тести на основі секвенування вимагають більшої тривалості аналізу (принаймні 12 годин) і наявності спеціалізованого обладнання в цент­ралізованих установах.

Фармацевтичні препарати для лікування COVID-19.
Незважаючи на зусилля найкращих лабораторій і фармацевтичних компаній світу, поки що не винайдено специфічних та ефективних ліків проти COVID-19. У зв’язку з цим ­ВООЗ ініціювала глобальну програму всесвітнього клінічного випробування Solidarity, в рамках якої здійснюється не лише пошук нових препаратів для лікування COVID-19, а й масовий скринінг дії на SARS-CoV-2 наявних препаратів (переважно противірусних), які вже мають дозвіл на використання для лікування чи на клінічні випробування. Ймовірно, що ефективні препарати для лікування COVID-19 вдасться знайти раніше, ніж стане доступною вакцина для його профілактики.
Які ж препарати можна використовувати для боротьби з SARS-CoV-2? Вчені пропонують численні терапевтичні підходи, спрямовані на блокування різних етапів циклу реплікації коронавірусу (рис. 7).
По-перше, можна завадити вірусу проникнути в клітину, заблокувавши його взаємодію з рецепторами та допоміжними молекулами, необхідними для проникнення. Такими блокаторами можуть бути рекомбінантний АСЕ2 або антитіла проти поверхневих протеїнів SARS-CoV-2. Дослідження in vitro показали, що рекомбінантний протеїн АСЕ2 здатний уповільнити реплікацію SARS-CoV-2 та поширення інфекції в тканинах. Лікарський препарат на його основі вже пройшов клінічні випробування в Китаї і продемонстрував захисний вплив при гострому респіраторному дистрес-синдромі у хворих на COVID-19.
На відміну від “природних” антитіл, які виробляються в інфікованої людини проти SARS-CoV-2 і значною мірою є головною зброєю у боротьбі з хворобою, велика кількість лабораторій зараз працює над створенням штучних антитіл різної структури, які можна було б цілеспрямовано використовувати проти поширення вірусу.
З цією метою можна застосовувати різні підходи. Відомо, що вірус взаємодіє з рецепторами клітин-мішеней господаря (розпізнає ACE2- та/чи NRP1-рецептори) своїм шипоподібним S-протеїном, а точніше — його рецептор-зв’язувальним доменом (RBD). Логічно припустити, що штучні антитіла проти RBD, зокрема гуманізовані моноклональні антитіла, що синтезуються гібридомами, рекомбінантні антитіла, які утворюються відповідними культурами клітин, та їх похідні меншого розміру (scFv, нанободі) будуть перешкоджати взаємодії вірусу з клітиною-мішенню. І дійсно, при імунізації кролів протеїнами S, S1, RBD (але не S2) утворювалися сильні нейтралізувальні антитіла. Однак при імунізації RBD утворювали­ся антитіла з у 5 разів більшою спорідненістю до нативно- го вірусного протеїну S. Відомо, що протеїн S, який за допомогою RBD зв’язується з клітинним рецептором АСЕ2, є гомологічним на 77,5% у SARS-CoV і SARS-CoV-2. Нещодавно було одержано моноклональне антитіло, здатне нейтралізувати обидва ці види коронавірусів. Автори роботи створили повністю гуманізовані моноклональні антитіла проти субодиниці SARS2-S1 вірусу, які ефективно зв’язувалися з клітинами, що експресували повнорозмірний S протеїн вірусів SARS-CoV та SARS-CoV-2. Ці антитіла також сильно гальмували взаємодію вірусів SARS-CoV та SARS-CoV-2 з клітинами VeroE6 (з величиною IC50 = 0,061 мкг/мл для обох вірусів).
Дослідники з Каролінського Інституту у Швеції одержали нанободі альпаки Ty1, яке зв’язується з вірусним доменом RBD, доступним у конформаціях як “вгору”, так і “вниз”, і стерично перешкоджає зв’язуванню RBD з клітинним рецептором ACE2. Ty1 нейтралізує псевдовирус SARS-CoV-2 у вигляді нанободі з масою 12,8 кДа, а злиття Ty1 з доменом Fc робить конструкцію надзвичайно ефективною. Особливістю нанободі, які в природі зустрічаються також у верблюдів, є дуже маленький розмір (менше однієї десятої) у порівнянні з класичним антитілом. Завдяки цьому нанободі можуть бути зручними інструментами досліджень і терапевтичними агентами, які не викликають у людини сторонніх імунних реакцій і можуть бути легко і дешево отримані в промислових масштабах. Зараз розпочинаються доклінічні дослідження нанободі Ty1 на тваринах для перевірки нейтралізуючої активності та терапевтичного потенціалу in vivo.
Розроблення таких “таргетних” антитіл розпочалося відразу після публікації структури геному вірусу, коли з послідовності нуклеотидів РНК можна було уявити амінокислотну послідовність S-протеїну та його RBD (багато в чому аналогічного S-протеїну SARS) і хоча б приблизно розрахувати просторову структуру антиген-зв’язувального домену конструйованих антитіл.
Слід зазначити, що антитіла до інших епітопів коронавірусу (крім RBD) також можуть мати сильні захисні властивості, оскільки є й інші механізми нейтралізації SARS-CoV-2 крім блокування взаємодії RBD з клітинним рецептором АСЕ2. Так, моноклональне антитіло 4A8 проти N-кінцевого домену (NTD) протеїну S не взаємодіє з RBD, але може нейтралізувати SARS-CoV-2, ймовірно, завдяки перешкоджанню конформаційним змінам протеїну S.
Інший підхід використали вчені лабораторії молекулярної імунології Рокфеллерівського університету. Із крові понад 100 осіб, які перехворіли на COVID-19 і видужали, було відібрано більш як 10 зразків антитіл, що ефективно блокували поширення вірусу та інактивували його. Просторова структура цих антитіл стала основою для розроблення штучних антитіл, з яких планують створити ефективні ліки проти COVID-19. Варто зазначити, що активними проти вірусу можуть бути антитіла не лише проти RBD, а й проти інших частин S-протеїну чи проти інших протеїнів поверхні вірусу.
Дослідження специфічності і дії антитіл проти вірусу є вкрай важливим і для розроблення профілактичної вакцини проти вірусу, оскільки вакцинація має викликати імунну відповідь та імунну пам’ять саме проти тих частин вірусу, які перешкоджатимуть його розвитку в організмі імунізованої людини. Терапевтичні антитіла і вакцини не є конкурентами, вони не виключають одне одного, а скоріше доповнюють. І терапевтичні антитіла (увага: тут не йдеться про антитіла, що містяться в плазмі хворих людей, які видужали!), і вакцини зараз проходять клінічні випробування, і, напевне, антитіла з’являться на ринку раніше за вакцини, але коштуватимуть значно дорожче. Так, антитіла, які використовуються при лікуванні різних злоякісних пухлин (таких вже є у продажу кілька десятків) та СНІД, коштують від кількох десятків до сотень тисяч доларів за курс лікування.
Великий інтерес становлять антитіла, які не виявляють нейтралізувальних властивостей в експериментах in vitro, але захищають від коронавірусу в умовах in vivo. Кристалографічне дослідження такого антитіла (CR3022) в комплексі з RBD показало, що воно розпізнає епітоп, який утворюється, коли щонайменше два з трьох RBD на “шипі” коронавірусу перебувають у конформації “вгору” і трохи повертаються.
Ідея створення і застосування високоефективних антитіл проти COVID-19, що забезпечують при введенні тимчасовий захист від коронавірусу, останнім часом набуває дедалі більшого розвитку. Зазвичай препарати на основі антитіл найчастіше використовують для лікування раку та ВІЛ-інфекції, але деякі з них застосовують і проти респіраторних інфекційних захворювань, наприклад проти респіраторно-синцитіальної вірусної інфекції у дітей. Біотехнологічна компанія Regeneron Pharmaceuticals (США) розробила препарат REGN-EB3, що складається з трьох антитіл проти вірусу Ебола. Цей препарат успішно пройшов випробування, сприяючи зниженню рівня смертності під час спалаху Еболи в Конго у 2018 р. Зараз ця компанія працює над створенням терапевтичних антитіл проти COVID-19 і вже розпочала клінічні випробування коктейлю з антитіл, розробленого з використанням антитіл від людей та гуманізованих мишей, що мають функціонуючі людські гени.
Ще кілька фармацевтичних компаній працюють над розробленням терапевтичних антитіл проти COVID-19. Насамперед це Eli Lilly (США) та AbCellera (Канада), які 17 червня 2020 р. розпочали ІІ фазу клінічних випробувань нейтралізувального антитіла LY-CoV555 проти COVID-19 за участі 400 хворих на COVID-19 легкої та середньої важкості. Це антитіло було розроблене з використанням крові пацієнта, який одужав від COVID-19 ще в лютому.
Наприкінці літа планувалося розпочати клінічні випробування так званих антитіл Рокфеллера — препарату з трьох антитіл до різних епітопів RBD, розробленого Рокфеллерівським університетом (США) на основі дослідження 149 людей, що перехворіли на COVID-19. Також розпочав клінічні випробування цього літа і Університет Вандербільта (США) у співпраці з Кембриджським університетом і фармацевтичною компанією AstraZeneca (Велика Британія), які, дослідивши антитіла десяти перших хворих на COVID-19 у США, знайшли близько 40 антитіл із сильними захисними властивостями проти нового коронавірусу. Компанія Sorrento Therapeutics (США) з серпня 2020 р. почала І фазу клінічних випробувань нейтралізувального антитіла STI-1499 проти COVID- 19, що було розроблено дослідниками з Утрехтського університету (Нідерланди).

Далі буде.

Поділись і насолодись:
  • Blogosvit
  • del.icio.us
  • Надішли другу посилання на статтю електронною поштою!
  • Facebook
  • Google
  • LinkedIn
  • MyNews
  • Роздрукуй на пам’ять!
  • Technorati
  • TwitThis

Related posts

Leave a Comment